Microscopie Biphotonique - FLIM - FCS

    Nous avons construit un microscope à excitation biphotonique combinant une imagerie à deux photons avec des modalités d’imagerie quantitative telles le FLIM et la FCS.

Experts Scientifiques
Ludovic Richert
Pascal Didier

Imagerie biophotonique quantitative
L’imagerie biphotonique offre de nombreux avantages comparés à la microscopie confocale, notamment en induisant moins de photo-dommages et en permettant une imagerie sur des échantillons plus épais (du fait d’une meilleure pénétration de la lumière IR par rapport à la lumière visible).

Microscopie d’Imagerie en Temps de Vie de Fluorescence (FLIM)
Le FLIM est une technique consistant à mesurer les temps de vie de fluorescence d’un fluorophore pour chaque pixel de l’image. Ils ne sont alors plus détectés selon leurs longueurs d’ondes d’émission mais seulement selon leur temps de vie. En utilisant le principe du Transfert Résonnant d’Energie de Fluorescence (FRET), les interactions protéine-protéine (l’une marquée par un donneur d’énergie de fluorescence et l’autre par un accepteur) peuvent être résolues spatialement en mesurant le temps de vie de fluorescence du donneur. Le principal avantage de cette technique découle du fait que le temps de vie de fluorescence est un paramètre intrinsèque qui ne dépend pas de la concentration en donneur et de la puissance d’excitation du laser.


Spectroscopie par Corrélation de Fluorescence (FCS)
La FCS est une technique basée sur l’analyse des fluctuations d’intensité d’espèces fluorescentes diffusant à l’intérieur d’un volume de l’ordre du femtolitre (défini par le laser d’excitation). La constante de diffusion, la concentration locale et la brillance de chacune de ces espèces, étant reliées à leurs propriétés photophysiques et hydrodynamiques, peuvent ainsi être déterminées.

FCS à deux foyers
Pour déterminer avec une grande précision les coefficients de diffusion des espèces fluorescentes, un dispositif FCS à deux foyers à été construit, en utilisant un interféromètre de Michelson. La distance précise entre les deux foyers permet de surmonter les incertitudes sur la taille et de la forme du volume confocal, existant en FCS à un seul foyer.


FCS à balayage (sFCS)

En sFCS, le signal de fluorescence est collecté en balayant le faisceau laser sur l’échantillon. Dans ce cas, les fluctuations de fluorescence contiennent à la fois des informations spatiales et temporelles sur les espèces fluorescentes. Différents modes de sFCS sont disponibles selon les paramètres requis (FCS circulaire, RICS, N&B). Les techniques de sFCS sont particulièrement adaptées pour des espèces à diffusion lente.

Caractéristiques techniques

Modes d’acquisition
Imagerie biphotonique
Microscopie d’Imagerie en Temps de Vie de Fluorescence (FLIM)
Spectroscopie par Corrélation de Fluorescence (FCS)
FCS à deux foyers
FCS à balayage sFCS

Statif
Statif Olympus IX70
Platine XY motorisée Marhauzer
Porte objectif piezo Z P725 - PI
Source d’excitation 75 W Xe
Automatisme (shutter, scanner XY, modulateur de puissance,…) piloté par Labview

Détection
Détection déscannée avec deux photodiodes à avalanche (Perkin Elmer SPCM-14)
Détection non déscannée avec deux détecteurs hybrides (BH HPM 100-40)

Système d’acquisition:
Carte PCI 6602 (National Instrument) pour l’imagerie 2D/3D, sFCS
Autocorrélateur ALV 5000 (ALV Gbmh) pour la FCS et FCCS
Carte d’acquisition SPC 830 (Becker Hickl) pour le FLIM

Le système est piloté à l’aide d’une interface Labview développée au laboratoire et l’analyse des données est réalisée au moyen de différents outils (SPC Image, QuickFit, FijI) et d’outils développés au sein du laboratoire à partir de différentes plateformes (Labview, Matlab, IgorPro, Origin)

Laser
Laser femtoseconde Insight Spectra-Physics (680 nm/1300nm) pour la génération d’une excitation biphotonique avec pré-compensation.

Inserts- porte objet
Insert universel (Lames, Labtek, boites de ø 30mm, etc.)
Insert pour plaque (boites multipuits)

Accessoires
Enceinte à température régulée (PECON)
Table optique (Thorlabs)

Objectifs

Mag.N.A.QualityImm.WDRef
60x 1.2IR optimizedWater0.28UPLSAPO 60XW

N’oubliez pas de citer la plateforme dans les remerciements